Ziehl-Neelsen Stain (ZN-Stain): Prinsip, Prosedur, Pelaporan dan Modifikasi
Pewarnaan Ziehl-Neelsen (ZN stain) adalah jenis pewarnaan bakteriologis diferensial yang digunakan untuk mengidentifikasi organisme tahan asam, terutama Mycobacteria. Organisme tahan asam adalah bakteri yang mampu mempertahankan pewarnaan primer saat diberi dengan asam (fast = holding capacity). Actinomycetes, genus Nocardia (N. brasiliensis dan N. asteroid adalah patogen oportunistik) sebagian tahan asam. Ookista parasit coccidian, seperti Cryptosporidium dan Isospora, juga tahan asam.
Robert Koch mewarnai tubercle bacilli dengan cara merendam larutan hot alkali metilen selama 24 jam (1882)
Ehrlich menemukan sifat khas dari tahan asamn yaitu kemampuan untuk menahan dekolourisasi dengan asam (1882). Melakukan pewarnaan bacillus dengan fuchsin dasar dengan adanya minyak anilin sebagai mordan dan menggunakan minyak mineral encer untuk dekolorisasi.
Ziehl menggunakan asam karbol sebagai mordan, bukan minyak anilin (1882).
Rindfleisch memanaskan slide selama beberapa menit dan bukannya memasukkan larutan panas dan mengurangi waktu pewarnaan (1882).
Neelsen menggabungkan fuchsin dasar dan asam karbol bersama-sama dan menggunakan ini sebagai larutan tunggal (1883).
Sumber : http://cdn.biologydiscussion.com/wp-content/uploads/2016/05/clip_image014-17.jpg
PRINSIP ZIEHL-NEELSEN STAIN
Organisme seperti Mycobacteria sangat sulit untuk dicuri dengan metode biasa seperti Gram Stain karena kandungan lipidnya yang tinggi dari dinding sel. Senyawa fenolik karbol fuchsin digunakan sebagai noda utama karena lipid larut dan menembus dinding sel wax. Pewarnaan oleh carbol fuchsin lebih ditingkatkan dengan pemanasan uap persiapan untuk melelehkan lilin dan membiarkan noda bergerak ke dalam sel. Asam digunakan untuk mendekolorisasi sel yang tidak aman; sel tahan asam menolak dekolorisasi ini. Kemampuan bakteri untuk melawan dekolorisasi dengan asam memberi ketahanan asam- pada bakteri. Setelah dekolorisasi, smear dihitung dengan warna hijau perunggu atau biru metilen yang menodai bahan latar belakang, memberikan warna kontras di mana AFB merah dapat dilihat.
Alkohol asam juga dapat digunakan sebagai larutan dekolorisasi, organisme resisten disebut sebagai Asam Fast Bacilli (AFB) atau Asam Alkohol Fast Bacilli (AAFB).
PERSYARATAN
Pewarnaan utama: 0,3% Carbol Fuchsin - Larutkan 50g fenol dalam etanol 100 ml (90%) atau metanol (95%). Larutkan 3g fuchsin dasar dalam campuran dan tambahkan air suling untuk membawa volume menjadi 1 L.
Larutan dekolorisasi: 25% asam sulfat
Counter stain: 0,3% methylene blue atau malachite green.
PROSEDUR STAIN ZIEHL-NEELSEN
Buatlah noda tipis bahan untuk belajar dan memperbaiki panas dengan melewatkan slide 3-4 kali melalui nyala pembakar Bunsen atau gunakan peluncur hangat pada 65-75 C. Jangan terlalu panas.
Tempatkan slide pada rak pewarnaan dan tuang carbol fuschin di atas noda dan panas dengan lembut di bawah slide dengan melewatkan nyala api di bawah rak sampai asap muncul (tanpa mendidih!). Jangan terlalu panas dan biarkan selama 5 menit.
Bilas dengan air sampai tidak ada warna yang muncul dalam efluen.
Tuangkan 20% asam sulfat, tunggu selama satu menit dan terus mengulangi langkah ini sampai seluncuran tampak berwarna merah muda (15-20 detik).
Cuci bersih dengan air bersih.
Tutupi bekas luka dengan noda hijau metilen atau malasit hijau selama 1-2 menit.
Cuci noda dengan air bersih.
Usap bagian belakang seluncuran bersih, lalu letakkan di rak pengeringan untuk dioleskan ke tempat kering (jangan sampai kering).
Periksa smear secara mikroskopis, gunakan tujuan perendaman minyak 100x.
HASIL DAN INTERPRETASI
Asam Fast Bacilli: Batang merah, lurus atau sedikit melengkung, terjadi sendiri atau dalam kelompok kecil, mungkin tampak manik-manik.
Sel: Hijau (hijau perunggu) atau Biru (biru metilen)
Bahan latar belakang: Hijau (hijau perunggu) atau Biru (biru metilen)
Daftar Organisme Tahan Asam
Mycobacterium spp: Asam cepat
Kista Cryptosporidium: Asam Fast
Kista Isospora: Cepat Asam
Nocardia spp: Asam Partial Cepat
Rhodococcus spp: Asam Partial Cepat
Legionella micdadei: Asam secara parsial cepat dalam jaringan
PELAPORAN SPUTUM SMEAR
Bila ada bacilli merah yang pasti terlihat:
Laporkan smear sebagai 'AFB POSITIVE', dan berikan indikasi jumlah bakteri yang ada sebagai berikut:
Jumlah AFB terlihat (Pembesaran 1000X) Dilaporkan As
0 AFB per 300 Field AFB Tidak Terlihat
1-2 AFB per 300 Fields Diragukan; ulangi dengan spesimen lain
1-9 AFB per 100 lapang pandang 1+
1-9 AFB per 10 lapang pandang 2+
1-9 AFB per lapang pandang 3+
> 9 AFB per lapang pandang 4+
Apabila sangat sedikit AFB yang terlihat:
Misalnya. Bila hanya satu atau dua AFB yang terlihat, mintalah spesimen lebih lanjut untuk diperiksa. Air ledeng terkadang mengandung AFB yang menyerupai tubercle, dan kadang-kadang goresan bernoda pada slide bisa salah untuk AFB. Kadang-kadang AFB dapat ditransfer dari satu noda ke noda yang lain saat potongan kertas blotting yang sama digunakan untuk mengeringkan beberapa noda.
Bila tidak ada AFB yang terlihat setelah memeriksa 300 lapang pandang:
Laporkan smear sebagai 'AFB TIDAK TERLIHAT'. Jangan laporkan 'Negatif' karena organisme mungkin ada tapi tidak terlihat di bidang yang diperiksa. Sampai tiga spesimen (yang dikumpulkan sebagai spesimen pagi hari) mungkin perlu diperiksa untuk mendeteksi M. tuberkulosis dalam sputum.
MODIFIKASI STAIN ZIEHL-NEELSEN
Penggunaan alkohol sebagai decolorizer sekunder:
Setelah dekolorisasi primer dengan asam sulfat, smear dapat diobati dengan alkohol 95% sebagai decolorizer sekunder. M. tuberkulosis adalah asam cepat dan cepat alkohol, sedangkan mikobakteri saprophytic hanya asam dengan cepat.
Penggunaan asam-alkohol sebagai decolorizer:
Selain menggunakan asam sulfat 20%, HCl 3% dalam alkohol 95% dapat digunakan. Ini juga membedakan tuberkel bacilli dari mycobacteria saprophytic. Hal ini terutama digunakan dalam diagnosis tuberkulosis ginjal.
Modifikasi dalam persentase asam sulfat:
<5% H2SO4 untuk M. leprae.
1% H2SO4 untuk aktinomices dalam jaringan.
0,5% H2SO4 untuk kultur Nocardia.
0,25-0,5% H2SO4 untuk spora dan ookista Cryptosporidium dan Isospora.
Pewarnaan Ziehl-Neelsen (ZN stain) adalah jenis pewarnaan bakteriologis diferensial yang digunakan untuk mengidentifikasi organisme tahan asam, terutama Mycobacteria. Organisme tahan asam adalah bakteri yang mampu mempertahankan pewarnaan primer saat diberi dengan asam (fast = holding capacity). Actinomycetes, genus Nocardia (N. brasiliensis dan N. asteroid adalah patogen oportunistik) sebagian tahan asam. Ookista parasit coccidian, seperti Cryptosporidium dan Isospora, juga tahan asam.
Robert Koch mewarnai tubercle bacilli dengan cara merendam larutan hot alkali metilen selama 24 jam (1882)
Ehrlich menemukan sifat khas dari tahan asamn yaitu kemampuan untuk menahan dekolourisasi dengan asam (1882). Melakukan pewarnaan bacillus dengan fuchsin dasar dengan adanya minyak anilin sebagai mordan dan menggunakan minyak mineral encer untuk dekolorisasi.
Ziehl menggunakan asam karbol sebagai mordan, bukan minyak anilin (1882).
Rindfleisch memanaskan slide selama beberapa menit dan bukannya memasukkan larutan panas dan mengurangi waktu pewarnaan (1882).
Neelsen menggabungkan fuchsin dasar dan asam karbol bersama-sama dan menggunakan ini sebagai larutan tunggal (1883).
PRINSIP ZIEHL-NEELSEN STAIN
Organisme seperti Mycobacteria sangat sulit untuk dicuri dengan metode biasa seperti Gram Stain karena kandungan lipidnya yang tinggi dari dinding sel. Senyawa fenolik karbol fuchsin digunakan sebagai noda utama karena lipid larut dan menembus dinding sel wax. Pewarnaan oleh carbol fuchsin lebih ditingkatkan dengan pemanasan uap persiapan untuk melelehkan lilin dan membiarkan noda bergerak ke dalam sel. Asam digunakan untuk mendekolorisasi sel yang tidak aman; sel tahan asam menolak dekolorisasi ini. Kemampuan bakteri untuk melawan dekolorisasi dengan asam memberi ketahanan asam- pada bakteri. Setelah dekolorisasi, smear dihitung dengan warna hijau perunggu atau biru metilen yang menodai bahan latar belakang, memberikan warna kontras di mana AFB merah dapat dilihat.
Alkohol asam juga dapat digunakan sebagai larutan dekolorisasi, organisme resisten disebut sebagai Asam Fast Bacilli (AFB) atau Asam Alkohol Fast Bacilli (AAFB).
PERSYARATAN
Pewarnaan utama: 0,3% Carbol Fuchsin - Larutkan 50g fenol dalam etanol 100 ml (90%) atau metanol (95%). Larutkan 3g fuchsin dasar dalam campuran dan tambahkan air suling untuk membawa volume menjadi 1 L.
Larutan dekolorisasi: 25% asam sulfat
Counter stain: 0,3% methylene blue atau malachite green.
PROSEDUR STAIN ZIEHL-NEELSEN
Buatlah noda tipis bahan untuk belajar dan memperbaiki panas dengan melewatkan slide 3-4 kali melalui nyala pembakar Bunsen atau gunakan peluncur hangat pada 65-75 C. Jangan terlalu panas.
Tempatkan slide pada rak pewarnaan dan tuang carbol fuschin di atas noda dan panas dengan lembut di bawah slide dengan melewatkan nyala api di bawah rak sampai asap muncul (tanpa mendidih!). Jangan terlalu panas dan biarkan selama 5 menit.
Bilas dengan air sampai tidak ada warna yang muncul dalam efluen.
Tuangkan 20% asam sulfat, tunggu selama satu menit dan terus mengulangi langkah ini sampai seluncuran tampak berwarna merah muda (15-20 detik).
Cuci bersih dengan air bersih.
Tutupi bekas luka dengan noda hijau metilen atau malasit hijau selama 1-2 menit.
Cuci noda dengan air bersih.
Usap bagian belakang seluncuran bersih, lalu letakkan di rak pengeringan untuk dioleskan ke tempat kering (jangan sampai kering).
Periksa smear secara mikroskopis, gunakan tujuan perendaman minyak 100x.
HASIL DAN INTERPRETASI
Asam Fast Bacilli: Batang merah, lurus atau sedikit melengkung, terjadi sendiri atau dalam kelompok kecil, mungkin tampak manik-manik.
Sel: Hijau (hijau perunggu) atau Biru (biru metilen)
Bahan latar belakang: Hijau (hijau perunggu) atau Biru (biru metilen)
Daftar Organisme Tahan Asam
Mycobacterium spp: Asam cepat
Kista Cryptosporidium: Asam Fast
Kista Isospora: Cepat Asam
Nocardia spp: Asam Partial Cepat
Rhodococcus spp: Asam Partial Cepat
Legionella micdadei: Asam secara parsial cepat dalam jaringan
PELAPORAN SPUTUM SMEAR
Bila ada bacilli merah yang pasti terlihat:
Laporkan smear sebagai 'AFB POSITIVE', dan berikan indikasi jumlah bakteri yang ada sebagai berikut:
Jumlah AFB terlihat (Pembesaran 1000X) Dilaporkan As
0 AFB per 300 Field AFB Tidak Terlihat
1-2 AFB per 300 Fields Diragukan; ulangi dengan spesimen lain
1-9 AFB per 100 lapang pandang 1+
1-9 AFB per 10 lapang pandang 2+
1-9 AFB per lapang pandang 3+
> 9 AFB per lapang pandang 4+
Apabila sangat sedikit AFB yang terlihat:
Misalnya. Bila hanya satu atau dua AFB yang terlihat, mintalah spesimen lebih lanjut untuk diperiksa. Air ledeng terkadang mengandung AFB yang menyerupai tubercle, dan kadang-kadang goresan bernoda pada slide bisa salah untuk AFB. Kadang-kadang AFB dapat ditransfer dari satu noda ke noda yang lain saat potongan kertas blotting yang sama digunakan untuk mengeringkan beberapa noda.
Bila tidak ada AFB yang terlihat setelah memeriksa 300 lapang pandang:
Laporkan smear sebagai 'AFB TIDAK TERLIHAT'. Jangan laporkan 'Negatif' karena organisme mungkin ada tapi tidak terlihat di bidang yang diperiksa. Sampai tiga spesimen (yang dikumpulkan sebagai spesimen pagi hari) mungkin perlu diperiksa untuk mendeteksi M. tuberkulosis dalam sputum.
MODIFIKASI STAIN ZIEHL-NEELSEN
Penggunaan alkohol sebagai decolorizer sekunder:
Setelah dekolorisasi primer dengan asam sulfat, smear dapat diobati dengan alkohol 95% sebagai decolorizer sekunder. M. tuberkulosis adalah asam cepat dan cepat alkohol, sedangkan mikobakteri saprophytic hanya asam dengan cepat.
Penggunaan asam-alkohol sebagai decolorizer:
Selain menggunakan asam sulfat 20%, HCl 3% dalam alkohol 95% dapat digunakan. Ini juga membedakan tuberkel bacilli dari mycobacteria saprophytic. Hal ini terutama digunakan dalam diagnosis tuberkulosis ginjal.
Modifikasi dalam persentase asam sulfat:
<5% H2SO4 untuk M. leprae.
1% H2SO4 untuk aktinomices dalam jaringan.
0,5% H2SO4 untuk kultur Nocardia.
0,25-0,5% H2SO4 untuk spora dan ookista Cryptosporidium dan Isospora.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar